Der Androgenrezeptor ist ein therapeutisches Ziel beim desmoplastischen kleinzelligen Sarkom

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3057 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der desmoplastische kleine Rundzelltumor (DSRCT) ist ein aggressiver, meist unheilbarer Sarkom-Subtyp, der vorwiegend bei jungen Männern nach der Pubertät auftritt. Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Androgenrezeptor (AR) das Fortschreiten des Tumors in DSRCTs fördern kann. Der Mechanismus der AR-induzierten onkogenen Stimulation bleibt jedoch ungeklärt. Hier zeigen wir, dass Enzalutamid und AR-gerichtete Antisense-Oligonukleotide (AR-ASO) die durch 5α-Dihydrotestosteron (DHT) induzierte DSRCT-Zellproliferation blockieren und die Xenotransplantat-Tumorlast reduzieren. Genexpressionsanalysen und Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) wurden durchgeführt, um aufzuklären, wie AR-Signale zelluläre epigenetische Programme regulieren. Bemerkenswerterweise enthüllte ChIP-seq neue DSRCT-spezifische AR-DNA-Bindungsstellen neben wichtigen onkogenen Regulatoren, einschließlich WT1 (dem C-terminalen Partner des pathognomonischen Fusionsproteins) und FOXF1. Darüber hinaus besetzte AR Enhancer-Stellen, die den Wnt-Signalweg, die neuronale Differenzierung und die Entwicklung embryonaler Organe regulieren, was AR mit einer gestörten Zelllinienbindung in Verbindung bringt. Unsere Ergebnisse haben direkte klinische Auswirkungen, da von der FDA zugelassene, auf Androgene abzielende Wirkstoffe zur Behandlung von Prostatakrebs weit verbreitet sind.

Der desmoplastische kleine Rundzelltumor (DSRCT) ist ein aggressiver bösartiger Weichteiltumor, der bei postpubertären Jugendlichen und jungen Erwachsenen meist als große intraabdominale Masse auftritt, zusammen mit einer ausgedehnten Beschichtung seröser und subdiaphragmatischer Oberflächen durch Hunderte bis Tausende von bösartigen Knötchen . Aufgrund der unauffälligen Tumorlokalisation stellen sich fast alle Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium mit Bauchschmerzen oder Blähungen, Übelkeit, Verstopfung und Gewichtsverlust vor1.

Die Herkunft der DSRCT-Zellen ist unbekannt, und diese Tumoren weisen im Allgemeinen einen hochgradigen, schlecht differenzierten Zustand auf, der durch Zellnester unklarer Abstammung gekennzeichnet ist und offenbar eine epitheliale, muskuläre, mesenchymale und neuronale Differenzierung beigemischt mit einem ausgeprägten desmoplastischen Stroma aufweist2,3,4. Aufgrund ihrer Seltenheit mit einer altersbereinigten Spitzeninzidenz von 0,3–0,74 Fällen pro Million5 beschrieben Gerald und Rosai die DSRCT erst 1989 als einzigartige klinisch-pathologische Erkrankung6. Kurz darauf zeigten zytogenetische Analysen, dass DSRCT-Tumoren eine pathognomonische t(11;22)(p13:q12)-Chromosomentranslokation aufweisen, die das Ewing-Sarkom-Gen (ES) (EWSR1) mit dem Wilms-Tumorsuppressorgen (WT1) paart6,7, 8,9. Das resultierende chimäre 59-kDa-Fusionsprotein (FP) fördert zusammen mit dem heterozygoten Funktionsverlust des WT1-Tumorsuppressorproteins eine onkogene Wirkung, die das Überleben und Wachstum des Tumors verstärkt10.

Die Signalkaskaden PI3K/AKT und Androgenrezeptor (AR) gehören zu den am häufigsten aktivierten Signalkaskaden bei Krebs11,12. Angesichts der bemerkenswerten Beobachtung, dass 90 % der DSRCT-Fälle bei Männern nach der Pubertät auftreten (mit einem Durchschnittsalter bei Diagnose von 21,4 Jahren), untersuchten wir, wie AR zur Tumorentstehung und zum Überleben beiträgt4,13,14. Ein möglicher Zusammenhang zwischen AR und DSRCT, der erstmals von Fine et al. untersuchten im Jahr 2006 eine Reihe von 27 DSRCT-Patienten im fortgeschrittenen Stadium, die mindestens zwei Chemotherapien durchlaufen hatten15. In dieser retrospektiven multizentrischen Analyse wiesen 37 % der Proben laut Immunhistochemie ≥2+ auf, und überraschenderweise profitierten drei von sechs AR+-Patienten vorübergehend von der kombinierten Androgenblockade (CAB) der zweiten Generation mit Lupron und Bicalutamid. Trotz dieses vielversprechenden Aktivitätssignals wurde das AR-Targeting in der Klinik nicht weiter verfolgt, und zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels wurden in der Literatur keine weiteren Studien berichtet.

In der vorliegenden Arbeit verwenden wir DSRCT-Xenotransplantate und von Patienten stammende Tumorexplantate (PDXs), um die Erkenntnisse von Fine et al. zu erweitern. bis hin zu modernen AR-zielgerichteten Therapien wie Enzalutamid, die das Rückgrat der Behandlung von Prostatakrebs (PC) bilden16. Darüber hinaus präsentieren wir vielversprechende Wirksamkeitsdaten unter Verwendung eines experimentellen AR-zielgerichteten Antisense-Oligonukleotids (ASO), das das Tumorwachstum durch Unterdrückung der AR-Expression deutlich verzögerte. Abschließend präsentieren wir Ergebnisse der Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq), die auf ein neues mechanistisches Verständnis der Rolle von AR bei der Tumorgenität von DSRCT schließen lassen. Unsere Forschungsergebnisse belegen, dass DSRCT eine zweite AR-bedingte Malignität ist und implizit einen Weg zu klinischen Studien nahelegt, die sich auf AR-gesteuerte Behandlungsmöglichkeiten für diesen ansonsten hartnäckigen Kinderkrebs konzentrieren.

Angesichts der Unterschiede im klinischen Erscheinungsbild, der Tumorbiologie und der Reaktion auf biologisch gezielte Therapien führten wir ein Reverse-Phase-Protein-Lysat-Array (RPPA) durch, um mit DSRCT angereicherte Proteine ​​zu identifizieren. Um tumorspezifische Proteine ​​zu bestimmen, verglichen wir Proteinlysate aus DSRCT-Knötchen und paarten benachbartes normal erscheinendes Mesenterialgewebe derselben Patienten unter Verwendung einer gut beschriebenen RPPA-Plattform, die mit bekannten Onkoproteinen angereichert war (ergänzende Abbildung S1)17,18,19. Durch unbeaufsichtigtes doppelhierarchisches Clustering wurden normale Mesenterialgewebe korrekt von DSRCT getrennt, das Akt, Syk, PKC-α und andere Proteine ​​überexprimierte. Als nächstes identifizierten wir Proteine, die mit DSRCT angereichert waren, im Vergleich zu anderen Malignomen, wobei wir ES als nächsten molekularen Verwandten verwendeten, der einen N-terminalen EWSR1-Fusionspartner teilt. Interessanterweise waren AR- und Syk-Proteine ​​in den meisten DSRCT-Proben hochreguliert, in ES jedoch nahezu nicht nachweisbar (Abb. 1a, b). Die durch Western Blots (WB) validierten RPPA-Daten liefern das erste Screening von mit DSRCT angereicherten Proteinen (Abb. 1c, d).

a Die Proteinlysate aus DSRCT (rot; n = 16) und ES (blau; n = 6) wurden einer RPPA-Analyse für 151 Proteine ​​und Phosphoproteine ​​(rot, erhöhtes Signal; grün, verringertes Signal) unterzogen. Durch unbeaufsichtigtes doppelhierarchisches Clustering unter Verwendung der Pearson-Korrelationsdistanzmetrik zwischen Proteinen (Zeilen) und der Centroid-Verknüpfung (eine Clustering-Methode) wurden die 22 Proben nach Tumortyp (Spalten) in zwei Gruppen unterteilt. Von den 22 Proteinen wiesen 8 eine Expression auf, die sich zwischen ES und DSRCT signifikant unterschied (p ≤ 0,05; Fold-Change ≥2). b Die mittleren Expressionsintensitätswerte der 8 mit DSRCT oder ES assoziierten Proteine ​​und ihre statistische Signifikanz nach Normalisierung für die globale Proteinexpression durch Medianzentrierung über 151 Antikörper im RPPA-Panel. c Western Blot wurde verwendet, um die durch RPPA identifizierten Proteine ​​als unterschiedlich exprimiert zwischen DSRCT und ES zu validieren. d Die normalisierte Proteinexpression ist relativ zu β-Actin. Die Datenpunkte in b und d stellen den Mittelwert ± SD dar. n ist die Anzahl der für jeden Sarkom-Subtyp analysierten Proben.

Da die AR-Aktivität eine Androgen-vermittelte Kerntranslokation erfordert, haben wir aus 60 am MD Anderson Cancer Center (MDACC) behandelten Fällen einen DSRCT-spezifischen Gewebe-Microarray (TMA) erstellt, um die Prävalenz und zelluläre Verteilung der AR-Färbung bei Patienten zu bestimmen, die an einer einzelnen Einrichtung behandelt wurden . 75 Prozent der für die Analyse verfügbaren Kerne waren immunhistochemisch positiv für nukleare AR (Abb. 2a, b und ergänzende Abb. S2a – c), normalerweise stärker in den Epithelzellen als in den desmoplastischen Stromazellen. Von den AR-positiven Proben zeigten 7 % eine fokale AR-Expression in 10–50 % seltenen, verstreuten Zellen und konnten von beliebiger Intensität sein (geringe positive AR-Expression), 3,3 % hatten eine niedrige AR-Expression, wo nur 1–10 % der Zellen vorhanden sind positiv für die AR-Expression (fokale Expression) und 25 % zeigten eine negative AR-Expression (wobei nur 0–1 % der Zellen positiv waren). 65 % zeigten eine hohe AR-Expression, definiert durch AR-Positivität in > 50 % der Zellen einer Probe (Abb. 2b und ergänzende Abb. S2c). Eine hochintensive Färbung wurde als vollständige Verdeckung der nuklearen Hämatoxylin-Gegenfärbung definiert, während eine mäßige Färbung die Sichtbarmachung der Färbung ermöglichte. Eine schwache Färbung erforderte eine mindestens 200-fache Untersuchung der Zellen, um die Färbung zuverlässig zu erkennen. Als zusätzliches Maß für die AR-Expression untersuchten wir weitere 12 DSRCT-Patiententumoren auf AR-Expression mittels Western Blot: 42 % der Tumoren zeigten eine hohe AR-Expression, 33 % hatten eine mäßige AR-Expression und 25 % waren AR-negativ (Abb. 2c, d). Da IHC und Western Blot in etwa drei Viertel der untersuchten DSRCT-Fälle eine mäßige bis hohe AR-Expression zeigten, schien dies die RPPA-Ergebnisse zu untermauern.

a Ein Histogramm, das die AR-IHC-Expressionsniveaus von 60 menschlichen DSRCT-Tumoren zeigt, gruppiert nach Intensität (niedrig, mittel und hoch). Die demografischen Daten, einschließlich des entsprechenden Geschlechts (rot: männlich oder grün: weiblich), des Alters bei der Diagnose und der Behandlung vor/nach der Chemotherapie bis zur Operation jedes primären oder metastasierten resezierten Tumorpatienten, werden jeweils links angezeigt Histogramm. b Interpretation des AR-Expressionsniveaus auf der DSRCT-TMA-IHC-Färbung und prozentuale Bewertung der Tumormarkierung (positiv (>50 %), schwach positiv (10–50 %), fokal (1–10 %) und negativ (0–1 %) ). c Western-Blot-Analysen der AR-Expression in 11 DSRCT-schockgefrorenen Primärtumoren. AR-Ausdruck: P = positiv, N = negativ oder M = mäßig. d Relative AR-Werte in den in c gezeigten Proben. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SD. e Das Diagramm der Hauptkomponentenanalyse, das zur Genexpression von Prostatakrebs (PC), DSRCT und weiteren Arten von Sarkomproben durchgeführt wurde. f Boxplot für das AR-Genexpressionsniveau bei DSRCT, Prostatakrebs und vier anderen Sarkomtypen. Der Wilcoxon-Rangsummentest wurde durchgeführt, um die AR-Werte zwischen DSRCT (n = 22) und allen anderen Krebsarten zu vergleichen. PC = Prostatakrebs (n = 12); CS = Chondrosarkom (n = 7); OS = Osteosarkom (n = 47); WDLPS = gut differenziertes Liposarkom (n = 7) und DDLPS = dedifferenziertes Liposarkom (n = 10). ***p-Wert < 0,001, **p-Wert < 0,01 und *p-Wert < 0,05.

Angesichts der männlichen Dominanz der DSRCT, neuer Daten zur AR-Proteinexpression und der bekannten Fülle an AR-zielgerichteten Therapien für PC haben wir uns entschieden, AR als potenzielles therapeutisches Ziel bei der DSRCT zu verfolgen. Der Fallbericht von Fine et al. deuteten an, dass DSRCT-Patienten kurzzeitig auf ein CAB der ersten Generation reagieren können, was unsere Begeisterung für die Untersuchung, wie AR-Signale zur DSRCT-Biologie beitragen, verstärkte15.

Angesichts der zentralen Rolle des AR für das PC-Wachstum und -Überleben und des umfassenden mechanistischen Verständnisses dieser Malignität20,21,22,23 führten wir eine Genexpressionsanalyse durch und verglichen 22 DSRCT-Proben mit 12 PC-Proben und einer Gruppe anderer verschiedener Sarkom-Subtypen, darunter 7 Chondrosarkome, 7 gut differenzierte Liposarkome, 10 dedifferenzierte Liposarkome und 47 Osteosarkomproben, die als Negativkontrollen dienten. Wie erwartet zeigte DSRCT eine signifikante AR-Hochregulation im Vergleich zu diesen anderen Sarkomproben von Chondrosarkom, gut differenziertem und dedifferenziertem Liposarkom und Osteosarkom (p < 0,01–p < 0,0001), übertraf jedoch nicht die bei PC beobachteten Werte (Abb. 2e, f). ).

Im Vergleich zu anderen Sarkom-Subtypen gruppierten sich die meisten DSRCT-Proben aufgrund ihrer Expression von 89 Genen, die mit dem Androgenweg assoziiert sind, wie von KEGG definiert (ergänzende Abbildung S2d). In ähnlicher Weise gruppierten sich DSRCT-Proben durch die Expression von 55 Genen, die mit der kanonischen Androgensignalisierung verbunden sind (ergänzende Abbildung S2f). Bemerkenswerterweise gruppierten sich PC und DSRCT, abgesehen von anderen Sarkom-Subtypen, in einem eigenen Zweig, basierend auf den 1500 unterschiedlichsten Genen aller Proben (Abb. 3). Die Pathway-Analyse ergab, dass im Vergleich zu anderen Sarkom-Subtypen andere mit DSRCT angereicherte Krebs-Pathways aufgedeckt wurden. Dazu gehörten der Zell-Adhäsionsmolekül-Kommunikationsweg, der die Zellinvasion durch ein koordiniertes Gleichgewicht zwischen Adhäsion und Ablösung von Zellen reguliert24,25 und der Interaktionsweg der extrazellulären Matrix (ECM), der bekanntermaßen die Zellmotilität über die ECM-Barriere hinweg initiiert26.

Die 1500 variabelsten Gene aller Proben wurden verwendet, um DSRCT mit PC und anderen Sarkom-Subtypen zu vergleichen. Durch unbeaufsichtigtes doppelhierarchisches Clustering wurde DSRCT neben PC auf Zweig 1 platziert. Andere Sarkom-Subtypen gruppierten sich auf Zweig 2. Deutliche Blöcke innerhalb der Heatmap weisen auf Gene hin, die in PC und DSRCT im Vergleich zu anderen Sarkom-Subtypen überexprimiert (A) oder unterexprimiert (B) sind. Innerhalb des Zweigs 1 waren einige Gene in PC (C) im Vergleich zu DSRCT (D) streng hochreguliert. PC = Prostatakrebs (n = 12); OS = Osteosarkom (n = 47); CS = Chondrosarkom (n = 7); WDLPS = gut differenziertes Liposarkom (n = 7) und DDLPS = dedifferenziertes Liposarkom (n = 10).

AR-Spleißvarianten (AR-Vs) sind mit dem Fortschreiten des PC-Tumors, einem erhöhten Risiko eines biochemischen Rückfalls und schlechteren Gesamtüberlebensergebnissen verbunden27,28,29. Um festzustellen, ob es in der DSRCT Varianten von AR gibt, haben wir die AR-V7-Expression in einer Kohorte von zwölf aufeinanderfolgenden DSRCT-Patienten untersucht. Da keine der ersten zwölf Proben AR-V von IHC exprimierte, haben wir uns entschieden, dies im breiteren Probensatz nicht weiter zu untersuchen.

Da die AR-Aktivität durch Integrine und Transkriptions-Co-Regulatoren30,31 beeinflusst werden kann, haben wir diese AR-Aktivatoren innerhalb derselben Kohorte von 11 DSRCT-Tumoren auf proteomischer Ebene mithilfe einer Western-Blot-Analyse bewertet. Unter drei häufig in mesenchymalen Geweben beobachteten Alpha-Integrin- (ITGAV, ITGA4 und ITGA5) und Beta-Integrin-Untereinheiten (ITGB1, ITGB3 und ITGB5) variierte die Proteinexpression erheblich und korrelierte nicht mit der AR-Expression (ergänzende Abbildung S3a).

Da die epigenetischen Wirkungen von AR durch Cofaktorbindung und Matrixmetalloproteine ​​verändert werden können, haben wir untersucht, ob die Steroidrezeptor-Koaktivatoren NCOA1/2/3 oder MMP2/13 durch AR-abhängige Mechanismen zur Entwicklung von DSRCT beitragen32,33,34,35,36 ,37. Um dies zu erreichen, führten wir eine WB von 11 primären DSRCT-Tumoren und den PC-Zelllinien JN-DSRCT und LNCaP durch. Die drei NCOA-Biomarker zeigten in den klinischen DSRCT-Proben eine heterogene Expression proportional zu ihrer AR-Expression (ergänzende Abbildung S3b). Die JN-DSRCT-Zellen zeigten jedoch eine geringe Expression von NCOA1/2 und eine äquivalente Expression von NCOA2 im Vergleich zu LNCaP-PC-Zellen (ergänzende Abbildung S3c). Weitere Untersuchungen mit einem größeren Probensatz sind erforderlich, um festzustellen, wie sich der AR-abhängige Integrin/NCOA-abhängige Signalweg auf die Migration und den Tod von DSRCT-Zellen auswirkt.

Obwohl die AR-Aktivierung durch Testosteron und DHT zu einer lebhaften Proliferation von PC-Zellen führt38, war es ungewiss, ob DSRCT-Zellen in ähnlicher Weise auf AR-Signale für Proliferation, Wachstum und Überleben angewiesen waren. Um dies zu bewerten, führten wir In-vitro-Zellproliferationstests nach DHT-vermittelter AR-Stimulation in JN-DSRCT durch; AR-exprimierende LNCaP-PC-Zellen, AR-nicht-exprimierende PC3-PC-Zellen und ES-TC71-Zellen, die als positive oder negative Kontrollen verwendet wurden. Wie vermutet, erhöhte die DHT-Stimulation die Zellproliferation von JN-DSRCT- und LNCaP-Zellen im Vergleich zu PC3- und ES-Zellen (Abb. 4a). Gemessen durch Western Blot bestätigten wir eine starke AR-Expression durch LNCaP- und JN-DSRCT-Zelllinien nach DHT-Stimulation im Gegensatz zu ihrer Abwesenheit in den TC71 ES- und PC3 PC-Zellen (Abb. 4b). Als nächstes führten wir eine konfokale Immunfluoreszenzfärbung dieser Zellen durch, um zu bestimmen, ob (und wie schnell) eine DHT-vermittelte Stimulation die AR-Transmigration vom Zytoplasma in den Zellkern erleichtern würde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die AR-Kerntranslokation innerhalb von 5 Stunden nach der DHT-Exposition beginnt und innerhalb von 24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht (Abb. 4c, d).

ein JN-DSRCT-, TC71-, LNCaP- und PC3-Zellproliferationstest nach dosisabhängiger Behandlung mit einem AR-Agonistenhormon, Dihydrotestosteron (DHT). n ist die Anzahl der experimentellen Replikate. b Profilierung von JN-DSRCT-, TC71- und LNCaP-Zellen auf ihre AR-Expression durch Western Blot und Histogrammdarstellung der relativen AR-Spiegel über jede Zelllinie hinweg. c Profilierung von JN-DSRCT-Zellen für die AR-Proteinexpression (grün) durch Immunfluoreszenzanalyse mit DAPI-markierten Kernen (blau), d quantitative Streudiagrammdarstellung des Verhältnisses der mittleren AR-/Zytoplasma-AR-Intensität, berichtet innerhalb einer einzelnen Zelle bei 0, 5 und 24 Stunden DHT-Nachbehandlung. e JN-DSRCT-Zellen sind relativ weniger empfindlich gegenüber Enzalutamid als (f) Behandlung mit AR-Antisense-Oligonukleotiden, wie der zellbasierte In-vitro-WST1-Proliferationstest zeigt. g Western-Blot-Analyse der AR-Expression in unbehandelten JN-DSRCT-Zellen oder nach Kontroll-ASO- und AR-ASO-Behandlungen. Histogrammdarstellung der relativen AR-Spiegel über jede Zelllinie nach GAPDH-Normalisierung. Die Datenpunkte in a, e und f stellen den Mittelwert ± SEM unter Verwendung von drei experimentellen Replikaten für jede Zelllinie dar. Die Daten in b (unteres Feld), d und g (unteres Feld) stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. P-Werte berechnet durch ungepaarten zweiseitigen t-Test.

Nachdem wir gezeigt hatten, dass DHT DSRCT-Zellen stimuliert, untersuchten wir, ob von der FDA zugelassene und experimentelle AR-Antagonisten eine antiproliferative Wirkung haben. Sowohl Enzalutamid (Abb. 4e) als auch das neuartige AR-ASO (IONIS 560131; früher AZD5312) verlangsamten die DSRCT-Zellproliferation nach zwei Wochen signifikant (Abb. 4f) und reduzierten die AR-Expression (Abb. 4g). Allerdings war die antiproliferative Wirkung in vitro in den Zellen, die mit der AR-gezielten Antisense-Blockade behandelt wurden, viermal wirksamer (Abb. 4e, f). Bemerkenswerterweise erforderte dieser antineoplastische Effekt die gleichzeitige Verabreichung von DHT (ergänzende Abbildung S4). Insgesamt weisen diese Daten auf eine entscheidende Rolle der DHT-stimulierten AR-Expression bei der DSRCT-Zellproliferation hin und belegen schlüssig eine starke antineoplastische Wirkung von AR-Antagonisten.

Da nur eine DSRCT-Zelllinie existiert, haben wir unsere Bewertung der AR-Antagonisten auf die In-vivo-Umgebung ausgeweitet, indem wir das JN-DSRCT-Xenotransplantat und verfügbare DSRCT-PDXs verwendet haben. Immungeschwächte NSG-Mäuse mit JN-DSRCT-Xenotransplantattumoren, die mit Enzalutamid oder AR-ASO behandelt wurden, reduzierten die Tumorlast signifikant und verbesserten das Überleben bei gleicher Wirksamkeit im Vergleich zu Placebo- oder Kontrollgruppen während der ersten zwei Monate der Behandlung (Abb. 5a, b). Nach 2 Monaten begann sich das Tumorwachstum bei den mit Enzalutamid behandelten Mäusen zu beschleunigen, während die Wachstumsunterdrückung bei den Mäusen, die entweder mit 25 oder 50 mg/kg AR-ASO behandelt wurden, anhielt (p < 0,0001; Abb. 5a). Im Vergleich zu Enzalutamid zeigte das auf AR gerichtete ASO (25 und 50 mg/kg) eine überlegene antineoplastische Aktivität (Abb. 5a; p < 0,0001 bzw. p = 0,006). Die Auswirkungen von AR-ASO und Kontroll-ASOs wurden auch bei NSG-Mäusen (5 Mäuse/Gruppe) mit einem DSRCT-PDX untersucht (Abb. 5d – f). Wie erwartet zeigten Tumorwachstum und Kaplan-Meier-Kurven, dass mit AR-ASO behandelte Tumoren im Vergleich zur ASO-Kontrollgruppe eine deutlich geringere Tumorlast und ein verbessertes Überleben aufwiesen (p = 0,0097 bzw. p < 0,0001).

a–c Therapeutische Wirkung der AR-Blockade in JN-DSRCT-Xenotransplantaten in drei Wiederholungen. Das Volumen und Überleben tumortragender Mäuse wurde nach Behandlung mit Enzalutamid (25 mg/kg, orange), AR-ASO (25 mg/kg, normal rot; 50 mg/kg, gepunktet rot), Kontroll-ASO (grau) oder berichtet Placebo (schwarz). Das obere Feld (a) zeigt die individuellen Daten für jede Maus; Das mittlere Feld (b) zeigt einen geglätteten gruppierten Median der relativen Tumorvolumina. Das untere Feld (c) zeigt die Überlebens-Kaplan-Meier-Kurven jeder behandelten Gruppe von Mäusen. d–f Ähnliche Daten werden für einen DSRCT-PDX angezeigt, der mit denselben Wirkstoffen behandelt wurde. d Einzelne PDX-Daten, e geglättete PDX-Daten und f Kaplan-Meier-Kurven für den DSRCT-PDX. Die für die geglätteten Tumorwachstumskurven (b und e) angegebenen P-Werte wurden durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test berechnet. Die Kaplan-Meier-P-Werte wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) berechnet. n ist die Anzahl der behandelten Mäuse in jeder Behandlungsgruppe.

Obwohl beide Wirkstoffe das Tumorwachstum verzögerten, waren AR-ASOs in beiden präklinischen Modellen wirksamer als Enzalutamid. Daher konzentrierte sich unsere pharmakodynamische Analyse hauptsächlich auf die Wirkung der AR-ASO-Behandlung. Proteomisches Profiling durch RPPA (Abb. 6a), Western Blot (Abb. 6b, c), Immunfluoreszenz (Abb. 6d, e und ergänzende Abb. S5a–c) und Immunhistochemie (Abb. 6f–h und ergänzende Abb. S5d–) f) validierte den AR-ASO-vermittelten Abbau der AR-Expression im Xenotransplantat und PDX. Um weiter zu charakterisieren, wie sich AR-ASO mechanistisch von Enzalutamid unterscheidet, führten wir eine Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieanalyse von 38 gesammelten präklinischen Tierproben durch, die in Abb. 5 dargestellt sind. In Übereinstimmung mit früherer PC-Literatur wurde der AR-Verlust nach der AR-ASO-Behandlung destabilisiert Testosteron und reduzierte dessen intratumorale Expression (Ergänzende Abbildung S6)39,40. Als Negativkontrolle blieben die Corticosteronspiegel durch die AR-Blockade unverändert. Da die antineoplastische Wirkung von Enzalutamid darüber hinaus durch die Verhinderung der Ligand-AR-Bindung, die Reduzierung des AR-Transports zum Zellkern und die Beeinträchtigung der AR-DNA-Bindungsaffinität wirkt – anstatt die AR-Spiegel zu senken (ergänzende Abbildung S7a – e) –, war die Behandlung mit Enzalutamid nicht signifikant niedrigeres intratumorales Testosteron.

a Die Analyseplots der Hauptkomponenten und die Auswertungen des Reverse-Phase-Protein-Lysat-Arrays (RPPA) von JN-DSRCT- und PDX-Tumoren nach Therapien trennten die 32 Proben in vier Gruppen und identifizierten 37 Proteine, die statistisch signifikant mit der Behandlung assoziiert waren, mit einer Falscherkennungsrate ( FDR) von 0,05. b Immunblotting-Bewertung von JN-DSRCT-Xenotransplantat- und PDX-DSRCT-Tumoren nach AR-ASO-Behandlung. c AR-Normalisierung im Vergleich zu GAPDH innerhalb der präklinischen Tumorproben. Der AR-Biomarker war bei mit AR-ASO behandelten Mäusen im Vergleich zur Kontroll-ASO-Gruppe signifikant reduziert (p = 0,01). d Repräsentative AR-Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie-Quantifizierung der präklinischen JN-DSRCT- und PDX-Tumorproben innerhalb der einzelnen Zelle oder e der gemittelten behandelten Proben (Placebo, Kontroll-ASO und AR-ASO). f Immunhistochemische Auswertungsbilder von präklinischen JN-DSRCT- und PDX1-Tumorproben. IHC-Färbungen für AR in Primärtumoren von JN-DSRCT- und PDX-DSRCT-Mäusen nach Behandlung mit AR-ASO, Kontroll-ASO und Placebo. Es werden 100-μm-Maßstabsbalken angezeigt. g Repräsentative IHC AR-Mittelwertintensitätsquantifizierung der präklinischen JN-DSRCT- und PDX-Tumorproben innerhalb der einzelnen Zelle oder h der gemittelten behandelten Proben (Placebo, Kontroll-ASO und AR-ASO). Alle durch RPPA analysierten Tumoren wurden bei Tumorprogression oder am Ende des Experiments gesammelt, mit Ausnahme der AR-ASO-PD-Gruppe, die 10 Tage nach Beginn der Therapie gesammelt wurde, um eine pharmakodynamische Analyse zu ermöglichen. Die Daten in c, d, e, g und h stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. P-Werte berechnet durch ungepaarten zweiseitigen t-Test.

Um ein vorläufiges Verständnis der kurzfristigen pharmakodynamischen Auswirkungen der AR-Unterdrückung zu erlangen, wurde eine Gruppe von JN-DSRCT-Xenotransplantaten und DSRCT-PDXs 10 Tage nach ihrer AR-ASO-Behandlung (Abb. 6a, AR-ASO PD) zur Analyse durch RPPA gesammelt um frühe kompensatorische pharmakodynamische Veränderungen zu beurteilen. pS6, Akt, Östrogenrezeptor (ER), PD-1L, pAKT und andere Proteine ​​(Abb. 6a und ergänzende Abb. S7f – g) wurden hochreguliert. Andere haben berichtet, dass der PI3K-AKT-Signalweg pleiotrope Auswirkungen auf das Überleben, die Proliferation, den Stoffwechsel und die Wachstumspfade mehrerer bösartiger Erkrankungen hat41, und seine Blockade ist seit langem von Interesse bei der Behandlung von PC, wo es nach AR-Hemmung zu einem kompensatorischen Anstieg der AKT-Signalübertragung kommen kann42 . Bemerkenswerterweise wurde das gleiche AR-ASO (AZD5312), das in unseren präklinischen Experimenten verwendet wurde, bei Verabreichung an PC-Patienten (NCT03300505) gut vertragen. Daher könnte man diesen AR-ASO-Medikamentenkandidaten theoretisch ohne Verzögerung in DSRCT-spezifischen Phase-2-Studien untersuchen. Angesichts der begrenzten Natur unserer präklinischen Studien sind auch zukünftige Studien mit Enzalutamid von Interesse.

Um das AR-Transkriptionsprogramm in einer menschlichen JN-DSRCT-Zelllinie zu modellieren, haben wir die genomweiten AR-Bindungsprofile mithilfe von ChIP-Seq-Experimenten in unstimulierten oder DHT-stimulierten JN-DSRCT-Zellen bestimmt, die mit Kontroll-ASO oder AR-ASO behandelt wurden. Wie erwartet verstärkte die DHT-Behandlung die AR-Bindung an das Chromatin, wie anhand der Darstellung der durchschnittlichen Intensität aller signifikanten Peaks (p <1e−7) und der Heatmap (Abb. 7a) beurteilt wurde. Die DHT-Stimulation führte zu etwa 4000 neuen Peaks, die durch die Behandlung mit AR-ASO unterdrückt wurden (Abb. 7b und ergänzende Daten 1). Diese Bindungsstellen wurden an bekannten AR-Response-Elementen (AREs) und an Stellen für FOXA1 angereichert, einem Transkriptionsfaktor, von dem bekannt ist, dass er verdichtete DNA öffnet und mit AR in PC43 zusammenarbeitet (Abb. 7c und ergänzende Daten 1). In Übereinstimmung mit der Pathogenese von DSRCT stellten wir auch eine Anreicherung von WT1-Bindungsmotiven innerhalb der AR-Bindungspeaks fest (Abb. 7c), was auf mögliche Wechselwirkungen zwischen AR, FOXA1 und WT1 in JN-DSRCT-Zellen schließen lässt. Um die Gene neben den Peaks der AR-Bindungsstellen weiter zu charakterisieren, führten wir eine Signalweganalyse mit 700 Genen durch, die direkte Ziele von AR sind. Zu den hochregulierten Signalwegen gehörten der TNFα-Signalweg, die Hippo-Signalübertragung und Pluripotenzregulatoren (Abb. 7d und ergänzende Daten 1), und zu den Schlüsselgenen gehörten WT1, CTNNB1, SOX2, GLI2, FOXF1 und GATA6 (Abb. 7e, ergänzende Abb. S8d und). Ergänzende Daten 1).

a Heatmaps (linke Felder) und durchschnittliche Intensitätskurven (rechte Felder) von ChIP-seq-Reads (RPKM; Reads pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Reads) für AR-Bindungsregionen. AR-Bindungsstellen werden in einem 10-kb-Fenster (zentriert in der Mitte der Bindungsstelle) in Kontroll-ASO-, AR-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben angezeigt. b Venn-Diagramm, das die Überlappung aller AR-Peaks zwischen Kontroll-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben zeigt, um die AR-einzigartigen oder gemeinsamen Bindungsstellen zu identifizieren. c Liste der Motive des angereicherten Transkriptionsfaktors (TF) in AR-spezifischen Bindungsstellen. Motive werden mittels HOMER (Binomialtest) identifiziert. d Punktdiagramm, das deutlich angereicherte Wege für AR-spezifische Bindungsstellen zeigt. Die Punktgröße stellt das Genverhältnis dar und die Farben stellen angepasste p-Werte dar (exakter Fisher-Test). e IGV-Bilder, die die Anreicherung von AR-Peaks um die Gene WT1, SOX2, CTNNB1, GATA6, FOXF1 und GLI2 unter Verwendung aggregierter ChIP-seq-Profile von Kontroll-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben zeigen.

Nachdem wir die Auswirkungen der Androgenstimulation und des Androgenentzugs in JN-DSRCT-Zellen bewertet hatten, verglichen wir als nächstes DSRCT mit Daten aus PC-Zellen. Es gab signifikante Überlappungen an Stellen für die AR-Bindung an AREs (ergänzende Abbildung S8a), FOXA1-Motiven (ergänzende Abbildung S8b) und Stellen, die wichtige Krebspfade regulieren, einschließlich WNT, TGFβ, PI3K, MAPK, Hippo-Signalisierung, TNFα und Epithel -zu-mesenchymale Transformation (Ergänzende Abbildung S8c). Um die AR-Regulationsfunktion in DSRCT-Tumormausmodellen weiter zu bewerten, führten wir ChIP-seq an DSRCT-Xenotransplantat- und PDX-Proben durch. In Übereinstimmung mit den Zellliniendaten beobachteten wir eine unterdrückte AR-Bindung an das Chromatin durch die Behandlung mit AR-ASO (ergänzende Abbildung S9a, b). In ähnlicher Weise zeigte die Signalweganalyse der 5000 am häufigsten verlorenen AR-Bindungsstellen, auf die Gene abzielten, eine Anreicherung des MAPK-Signalwegs, der Hippo-Signalisierung, der Wnt-Signalisierung und der Pluripotenzregulatoren (ergänzende Abbildung S9c, d). Wir stellten auch eine Anreicherung der Bindungsmotive der AR- und FOX-Familie innerhalb der AR-Bindungspeaks sowohl in DSRCT-Xenotransplantat- als auch in PDX-Proben fest (ergänzende Abbildung S9e). Gene neben den Peaks der AR-Bindungsstelle zeigten in beiden Modellen auch eine hohe Überlappung mit DSRCT-spezifischen Genen (ergänzende Abbildung S9f). Schlüsselgene aus Zellliniendaten (Abb. 7e) zeigten auch eine Verringerung des AR-Signals nach AR-ASO-Behandlung (ergänzende Abb. S9g).

Mehrere Studien haben gezeigt, dass AR ein pro-tumorigenes Transkriptom aufbaut, indem es die aktive Enhancer-Landschaft (bewertet durch H3K27ac-Profile) bei PC-Progression neu programmiert44. Daher fragten wir, ob AR bei DSRCT eine ähnliche Rolle spielt, indem wir genomweite Profile auf H3K27ac-Markierungen in unstimulierten oder DHT-stimulierten JN-DSRCT-Zellen untersuchten, die mit Kontroll-ASO oder AR-ASO behandelt wurden. Wir stellten fest, dass mit AR-ASO behandelte nicht stimulierte Zellen im Vergleich zu mit ASO behandelten Kontrollzellen eine höhere Intensität und eine höhere Anzahl von H3K27ac-Peaks zeigten (Abb. 8a, b, ergänzende Abb. S10a und ergänzende Daten 2). In ähnlicher Weise erhöhte die AR-ASO-Behandlung in DHT-behandelten Zellen auch die aktiven Enhancer-Peaks im Vergleich zur Kontroll-ASO-Behandlung (Abb. 8a, b, ergänzende Abb. S10a und ergänzende Daten 2). Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu denen bei PCs, bei denen aktive Enhancer-Peaks positiv mit einer höheren AR-Aktivität verbunden sind44. Es wurde zuvor gezeigt, dass AR den MLL-Komplex und CBP/p300 rekrutiert, das für die aktive Enhancer-Markierung in PC45 verantwortlich ist. Um herauszufinden, welche Enhancer wahrscheinlich durch AR-Bindung und mögliche Rekrutierung von Enhancer-Markierungsproteinen abgeleitet wurden, überlappten wir die AR- und H3K27ac-Peaks in DHT-behandelten Zellen (ergänzende Abbildung S10b und ergänzende Daten 2). Anschließend haben wir diese AR-zielgerichteten Enhancer-Peaks mit stark exprimierten Genen in DSRCT gekreuzt (Abb. 8c und ergänzende Daten 2) (FC > 1,5, angepasster p-Wert <0,05 im Vergleich zu anderen Sarkom-Subtypen). Dort identifizierten wir die WNT-Signalübertragung und die Zelladhäsion als Haupttreiber, die auf Chromatinebene durch AR-abhängige aktive Enhancer-Programme reguliert werden (Abb. 8d). Zu den Genen mit direkter AR-Bindung und Enhancer-Gewinn gehörten wichtige Onkogene wie AXIN2 und CDK6 (Abb. 8e). Darüber hinaus untersuchten wir Veränderungen in Super-Enhancer-Regionen (SE), die eine hohe Dichte an TF-Bindungsmotiven beherbergen46,47,48. SEs in Kontroll-ASO-behandelten Zellen markierten wichtige Onkogene wie AKT3 und GRHL2, wohingegen SEs in AR-ASO-behandelten Zellen Tumorsuppressorgene wie RUNX1 und CUX1 markierten (Ergänzende Abb. S10c, d und Ergänzende Daten 3), die möglicherweise regulieren das AR-gesteuerte Transkriptom. Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass die AR-Aktivierung typische Enhancer und SE neu programmiert, um wichtige onkogene Signalwege in der DSRCT zu regulieren.

a Heatmaps (linke Felder) und durchschnittliche Intensitätskurven (rechte Felder) von ChIP-seq-Reads (RPKM; Reads pro Kilobase Transkript pro Million zugeordneter Reads) für typische Enhancer-Regionen. Enhancer-Regionen werden in einem 10-kb-Fenster (zentriert in der Mitte der Bindungsstelle) in Kontroll-ASO-, AR-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben angezeigt. b Venn-Diagramm, das die Überlappung aller Enhancer-Peaks zwischen Kontroll-ASO-, AR-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben zeigt, um die AR-einzigartige oder gemeinsame Enhancer-Neuprogrammierung zu identifizieren. c Venn-Diagramm, das die Überlappung annotierter Gene für AR-spezifische gewonnene Enhancer-Peaks und die Liste hochregulierter Gene für DSRCT-Tumoren im Vergleich zu anderen Sarkomtumoren zeigt, um die mit der AR-einzigen Enhancer-Reprogrammierung verbundene Hochregulierung der Transkription zu identifizieren. d Balkendiagramm, das deutlich angereicherte Wege für die AR-spezifische Enhancer-Reprogrammierung im Zusammenhang mit der Hochregulierung der Transkription zeigt. Die Balkenlänge stellt die Genzahlen dar und die Farben stellen angepasste p-Werte dar (exakter Fisher-Test). e IGV-Bilder, die die Anreicherung von H3K27Ac-Peaks um die Gene AGRE2, AXIN2, CDK6 und MYH10 unter Verwendung aggregierter ChIP-seq-Profile von Kontroll-ASO-, DHT + Kontroll-ASO- und DHT + AR-ASO-Proben zeigen.

Interessanterweise beobachteten wir auch in präklinischen Tumorproben eine ähnliche Enhancer-Reprogrammierung. Die AR-ASO-Behandlung des DSRCT-Xenotransplantats erhöhte die aktiven Enhancer- und Promotor-Bindungsstellen im Vergleich zur Kontroll-ASO-Behandlung signifikant, wohingegen PDX-Proben einen moderaten Anstieg zeigten (ergänzende Abbildung S11a – d). Wir beobachteten auch AR-abhängige aktive Enhancer, die PI3K-AKT-mTOR, WNT-Signalisierung, Zelladhäsionswege (ergänzende Abb. S11e, f) und wichtige Onkogene (Abb. 8e) regulieren, mit direkter AR-Bindung und Enhancer-Gewinn in beiden DSRCT -Xenotransplantat- und PDX-Modelle (Ergänzende Abbildung S11g).

Seit Ladanyi und Gerald die chromosomale Translokation EWSR1-WT18 entdeckten, wurde DSRCT mit den gleichen Chemotherapieschemata behandelt, die auch für ES verwendet werden. Zu den jüngsten Ausnahmen gehören ES-spezifische Wirkstoffe wie TK-216, die auf C-Terminus-ETS-Gene (z. B. FLI1 oder ERG) abzielen, oder Pazopanib, das eine bevorzugte Aktivität bei DSRCT und anderen Weichteilsarkomen zeigt49. Phase-II-Studien, in denen auf Neoantigene gerichtete monoklonale Antikörper, beispielsweise 8H9 in der DSRCT, getestet werden, zielen auch auf einzigartige Sarkom-Subtypen ab50.

Da drei Viertel aller DSRCT-Patienten typischerweise innerhalb von fünf Jahren an ihrer bösartigen Erkrankung erkranken, zielte unsere RPPA-Studie darauf ab, neue molekulare Ziele für die DSRCT zu definieren und unser therapeutisches Arsenal an biologisch zielgerichteten Therapien zu erweitern, die diese ansprechen (Abb. 1). Überraschenderweise wurden von 151 im RPPA bewerteten Proteinen SYK und AR am unterschiedlichsten exprimiert. Das SYK-Protein – bisher nicht in DSRCT beschrieben – ist eine Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase (auch bekannt als Milz-Tyrosinkinase), die häufig in hämatologischen Geweben vorkommt. Es wurde gezeigt, dass seine konstitutive Aktivierung die bösartige Umwandlung von B-Zellen in Lymphome oder Leukämien induziert. Daher befinden sich die oralen SYK-Inhibitoren Cerdulatinib (Portola Pharmaceutical) und Entospletinib (Gilead Sciences) in aktiver klinischer Forschung zur Behandlung bestimmter Lymphome, chronischer lymphatischer Leukämie und akuter myeloischer Leukämie (NCT01994382 und NCT02457598). Ein oral wirksamer SYK-Inhibitor, Fostamatinib, hat bereits die FDA-Zulassung zur Behandlung von Immunthrombozytopenie erhalten und wird weiterhin als experimentelle Therapie für hämatologische Malignome untersucht (NCT00446095). Obwohl es verlockend ist, zu bedenken, dass die SYK-Hyperaktivierung eine onkogene Rolle bei der DSRCT spielt, hatten wir noch keine Gelegenheit, diese relativ neuen Medikamente in unseren präklinischen DSRCT-Modellen zu bewerten.

Im Gegensatz zu SYK standen zahlreiche von der FDA zugelassene und experimentelle AR-Antagonisten zur sofortigen präklinischen Bewertung zur Verfügung und waren möglicherweise für Patienten über Compassionate Access oder klinische Frühphasenstudien verfügbar. Obwohl unsere RPPA-Daten und das Verhältnis von Männern zu Frauen von 9:1 darauf hindeuteten, dass es sich bei der DSRCT um eine AR-bedingte Malignität handelt, haben wir zum expliziten Beweis mehrere Kriterien vorgeschlagen, die den Koch-Postulaten ähneln: (a) Tumore müssen AR angemessen exprimieren, (b) DHT muss die Proliferation von DSRCT-Zellen stimulieren, und (c) AR-Antagonisten sollten die tumorfördernden Wirkungen der Androgenstimulation einschränken. Die Einbeziehung mechanistischer Studien, einschließlich solcher, die AR direkt mit AREs in Verbindung bringen, erhöht die Glaubwürdigkeit, dass es sich bei der DSRCT um eine zweite AR-bedingte Malignität handelt.

Bisher wurde das erste Kriterium – die Notwendigkeit einer AR-Expression – von zwei früheren Teams beschrieben, die die auffällige Vorliebe von DSRCT für junge Männer erkannten15,51. Wie in der Einleitung kurz besprochen, haben Fine et al. bewerteten die Proteinexpression von AR, c-Kit, EGFR und anderen Proteinen durch WB und IHC, bewertet anhand einer 5-Punkte-Skala, die zwischen 0 (keine Färbung) und 4+ (sehr positiv) reichte15. Zehn von 27 (37 %) DSRCT-Patienten in ihrer Fallserie erzielten einen Wert von 2+ oder höher, wir heben jedoch hervor, dass 15 keine AR-Expression zeigten (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass prospektive Studien die Reaktion nach AR-Status stratifizieren möchten, um festzustellen, ob Die AR-Expression korreliert mit der therapeutischen Wirksamkeit. Eine neuere Studie, die 2018 von Bulbul et al. veröffentlicht wurde. verwendete an der UCSD IHC und Next-Generation-Sequenzierung bei Tumoren von 35 DSRCT-Patienten (86 % waren männlich); 59 % waren AR-positiv unter Verwendung eines dichotomen Cut-offs, der eine Färbung von ≥1+ in ≥10 % der Zellen erforderte51. In der vorliegenden Studie berichten wir über die umfangreichste Serie von DSRCT-Patienten, bei denen ein Protein- und Transkriptom-Profiling durchgeführt wurde. Obwohl AR mit Onkoproteinen angereichert ist, stufte unser RPPA-Array AR im Vergleich zu ES, seinem nächsten molekularen Sarkom-Subtyp, als das am unterschiedlichsten exprimierte Protein ein (Abb. 1). Unsere anschließende Bestätigung der RPPA-Ergebnisse durch WB und die spätere semiquantitative Analyse durch IHC stimmen mit früheren Berichten überein und scheinen AR als echtes Ziel in DSRCT zu untermauern.

Ein 72-Stunden-Zellproliferationstest erfüllte das zweite von Kochs Postulat und zeigte einen signifikanten Anstieg der JN-DSRCT-Zellproliferation nach Exposition gegenüber physiologischen DHT-Spiegeln (Abb. 4a), wenn auch niedriger als bei LNCaP-PC-Zellen. Wie man es in androgenempfindlichen Zellen erwarten würde, förderte DHT auch den nuklearen Transport von AR in den Zellkern, wo es als Transkriptionsregulator seiner Zielgene fungierte (Abb. 4c, d). Da unsere Ergebnisse auf Daten einer einzelnen Zelllinie basieren (der einzigen, die zu diesem Zeitpunkt existierte), bleiben wir wachsam, um eine Überinterpretation dieser Daten zu vermeiden. Dennoch spiegeln unsere Ergebnisse ähnliche Ergebnisse von Fine et al. wider, wo sie über einen DHT-induzierten zweifachen Anstieg der Zellproliferation in einer vorübergehenden DSRCT-Zelllinie berichteten, die aus Aszitesflüssigkeit gewonnen wurde18.

Unser Team erfüllt die dritte Anforderung, die eine AR-bedingte Malignität definiert, und stärkt damit erneut die Arbeit von Fine et al., die vor mehr als einem Jahrzehnt einen vorausschauenden Schritt zur Bewertung von CAB unternommen hatten – in diesem Fall durch die Verwendung von Lupron und Bicalutamid in sechs DSRCT Patienten, die AR-positiv waren (3+ oder 4+ laut IHC)18. Interessanterweise waren in ihrem begrenzten Pilotversuch Testosteronwerte auf nicht kastriertem Niveau mit mäßigen Reaktionen verbunden, die drei bis vier Monate anhielten. Zugegebenermaßen beobachtete unser Team, nachdem es zwischen 2006 und 2015 mehrere DSRCT-Patienten mit der gleichen Arzneimittelkombination getestet hatte, lange vor der Einführung moderner Androgenentzugstherapien wie Abirateron und Enzalutamid, einen begrenzten klinischen Nutzen, der <3 Monate andauerte. Unsere erneute Begeisterung für das AR-Targeting in der DSRCT resultierte aus den RPPA-Expressionsergebnissen, begleitet von den In-vitro-DHT-Stimulationsstudien und In-vivo-Daten mit Enzalutamid und AR-ASO (Abb. 5).

In Vorbereitung auf klinische Studien in der Frühphase, die sich derzeit in der Entwicklung befinden, unternimmt unsere Arbeit den ersten Schritt, um unser mechanistisches Verständnis der AR-Signalübertragung in der DSRCT voranzutreiben. Als einer von mehreren Rezeptoren der Steroid- und Kernhormon-Superfamilie, zu denen der Glukokortikoidrezeptor, der Mineralokortikoidrezeptor, Progesteron- und Östrogenrezeptoren sowie der Vitamin-D-Rezeptor gehören, behält AR eine konservierte 66 Aminosäuren lange DNA-Bindungsdomäne, die zwei (5'- AGAACA-3') hexamere Halbstellen, angeordnet als umgekehrtes Palindrom mit einem Abstand von 3 bp (IR3). Aufgrund von Unterschieden im lokalen Steroidstoffwechsel, der Ligandenhäufigkeit, der Zugänglichkeit des Chromatins und der Cofaktorbelegung variiert das DNA-Bindungsmuster von AR in PC im Vergleich zu anderen Geweben erheblich52. Interessanterweise war FOXA1 unter den Pionierfaktoren, die die linienspezifische Bindung von AR an spezifische genomische Loci in PC53,54,55 und die AR-vermittelte Transkriptionsregulation von Prostatagenen (wie PSA)56 steuern, der am stärksten angereicherte MOTIF in JN-DSRCT-Zellen (Abb. 7c). Die gemeinsame Aktivierung der Androgensignalkaskade in DSRCT und PC könnte die in Abb. 2e beobachtete enge transkriptomische Häufung erklären. Trotz ihrer Ähnlichkeiten identifizierte ChIP-seq auch bemerkenswerte Unterschiede in der epigenetischen Regulation von AR an den Bindungsstellen von Enhancer (Abb. 8) und SE (ergänzende Abb. S9c).

Obwohl dies Gegenstand zukünftiger Forschung ist, vermuten wir, dass der heterotypische Verlust von WT1 oder aberrantem EWS-WT1 FP einen bestimmten Satz von Chromatinmodifikatoren an Bindungsstellen rekrutieren könnte, die sich von PC unterscheiden. Andere haben ChIP-seq in DSRCT-Patientenproben mit WT1-spezifischen Antikörpern durchgeführt, aber der in dieser Veröffentlichung verwendete Santa-Cruz-Antikörper57 wurde eingestellt. Mangels geeigneter ChIP-seq-validierter WT1-spezifischer Antikörper könnte ATAC-seq vor und nach der WT1-RNA-Stummschaltung verwendet werden, obwohl die Interpretation dieses Experiments angesichts des Fehlens eines selektiven Antagonismus von WT1 oder EWS-WT1 nicht so einfach wäre.

Interessanterweise zeigten unsere pharmakodynamischen Studien, wie es bei kastrationsresistentem PC11,58,59 der Fall ist, eine umgekehrte Beziehung zwischen AR und dem Akt/PI3K/mTOR-Signalweg. Da zahlreiche Inhibitoren von PI3K und mTOR bereits von der FDA zugelassen sind, wäre ein naheliegender nächster Schritt die Untersuchung, ob die gleichzeitige Ausrichtung von AR und entweder PI3K oder mTOR zu einer synergistischen Antikrebsaktivität führt. Obwohl in der vorliegenden Studie nicht untersucht, war die ER auch nach der AR-ASO-Behandlung stark ausgeprägt. Angesichts der gemeinsamen Bindungs-DNA-Motive, die ER, AR und andere Steroidhormonrezeptoren gemeinsam haben, legt diese Beobachtung nahe, dass ER-zielgerichtete Medikamente sich für Patienten mit kastrationsresistenter DSRCT und, plausibel, für die kleine Minderheit der Frauen, die diese erwerben, als nützlich erweisen könnten seltene Krebsart. Natürlich sind weitere Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, wie sich der Wechsel des AR- und ER-Signalwegs auf das Tumorwachstum und das Überleben auswirkt, sowohl bei DSRCT als auch bei anderen hormonell bedingten Malignomen60.

Obwohl sich unsere Daten morphologisch und phänotypisch von PC unterscheiden, deuten unsere Daten insgesamt darauf hin, dass DSRCT eine zweite Androgen-stimulierte Malignität ist (dritte, wenn man die AR-positive molekulare Untergruppe von dreifach negativem Brustkrebs berücksichtigt). Die gemeinsame Abhängigkeit von AR für Tumorwachstum und -überleben bietet eine spannende Gelegenheit, die AR-Signalübertragung bei einem anderen Krebstyp und bei einer jüngeren Patientenpopulation mit DSRCT zu untersuchen. Präklinische Daten zu Enzalutamid und AR-ASO legen die verlockende Möglichkeit nahe, dass AR-zielgerichtete Medikamente, die bei PC eingesetzt werden, auch bei der Bekämpfung von DSRCT von Nutzen sein könnten.

In Übereinstimmung mit allen relevanten ethischen Richtlinien erteilten die Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung zur Entnahme und Verwendung ihrer Tumorproben für Forschungszwecke unter Verwendung der Laborprotokolle LAB08-0151 oder LAB04-0890, die vom Institutional Review Board des MDACC genehmigt wurden. Die Krankenakten und elektronischen Krankenakten von Patienten mit einer bestätigten DSRCT-Diagnose wurden zur Analyse einbezogen und in der MDACC-Bioprobenbank oder den PI-Laboratorien des Kooperationspartners archiviert. Wir haben 60 DSRCT-Patienten identifiziert, die zwischen 1990 und 2019 am MDACC behandelt wurden, um eine TMA zu erstellen. Außerdem haben wir 16 DSRCT- und 6 ES-frischgefrorene Tumoren gesammelt, die alle durch RPPA profiliert wurden. Fachpathologen nutzten klinische Informationen, Immunhistochemie und zytogene Analyse für die EWSR1-WT1- oder EWSR1-FLI1-Fusionen, um die DSRCT- oder ES-Diagnosen zu bestätigen.

Die verfügbaren schockgefrorenen DSRCT- (n = 16) und ES-Proben (n = 6), die während einer Kernnadelbiopsie oder chirurgischen Debulking-Verfahren unter Verwendung klinischer Protokolle, die vom Institutional Review Board des MDACC genehmigt wurden, und Proben von normal erscheinendem Mesenterialgewebe neben der DSRCT entnommen wurden Die zum Zeitpunkt des chirurgischen Debulkings erhaltenen Daten (n = 8) wurden für die Proteomanalyse verwendet (Ergänzungstabelle 1: Aggregierte demografische Informationen von DSRCT- und ES-Patienten). Es wurden Lysate erstellt, Proteinkonzentrationen bestimmt und die individuelle Proteinexpression mithilfe gut validierter RPPA- und WB-Technologien gemessen, wie zuvor beschrieben61,62,63. Der AR-Proteinnachweis wurde mit dem CST-Antikörper (#5153) durchgeführt. Weitere Einzelheiten zu RPPA- und WB-Analysen und normalisierten Daten finden Sie in den ergänzenden Methoden und ergänzenden Daten 4.

Gesamt-RNA aus primären Tumorproben wurde extrahiert und Bibliotheken wurden aus cDNA unter Verwendung des NuGEN Ovation Ultralow Library System V2 (San Carlos, CA) erstellt. Die RNA-Sequenzierungsablesungen der Proben wurden mithilfe des STAR-Aligners64 auf das hg19-Referenzgenom abgebildet. Zur Berechnung der Genexpression wurden die rohen Zähldaten jedes Gens zunächst mit HTSeq65 ermittelt und durch Skalieren der Bibliotheksgröße mit calcNormFactors im EdgeR-Paket66 normalisiert. Anschließend wurde die Voom-Transformation auf normalisierte Zählungen angewendet und ein lineares Modell an die Daten zur Differentialausdrucksanalyse mithilfe des Limma-Pakets angepasst67. Pathway-Analysen unterschiedlich exprimierter Gene zwischen zwei Probenclustern wurden mithilfe der Gene Set Enrichment Analysis68 durchgeführt. Fusionstranskripte wurden mithilfe von MapSplice69 aus RNA-seq-Daten nachgewiesen.

Aus archivierten chirurgischen Pathologiematerialien wurde eine TMA erstellt, die 60 formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebe von 60 DSRCT-Patienten umfasste. Bereiche des lebensfähigen Tumors wurden durch pathologische Untersuchung ganzer H&E-gefärbter Schnitte des Objektträgers ausgewählt. Ausgewählte Bereiche wurden ausgestanzt und in zweifacher Ausfertigung mit einem ATA-100 Advanced Tissue Arrayer (Chemicon International) auf einen Empfängerblock übertragen. Alle menschlichen Proben wurden im Rahmen eines vom Institutional Review Board genehmigten Forschungsprotokolls (LAB04-0890) verwendet, das die retrospektive Probenahme und Analyse vorhandener Archivmaterialien ermöglicht, die während der Standardpatientenversorgung gesammelt wurden. Immunhistochemische Studien wurden unter Verwendung eines Autostainers (Bond-Max; Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA) mit Anti-AR-Antikörper (1:30; Klon AR441, Dako#M3562) durchgeführt. Weitere Einzelheiten zur TMA-Objektträgervorbereitung und IHC-Analysen finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Die JN-DSRCT-, LNCaP- und TC71-Zellen wurden in vitro mithilfe eines kolorimetrischen Assays in 96-Well-Platten mit WST1-Reagenz (Roche) auf ihre Proliferationskapazität getestet. Die Zellen wurden mit 3000 Zellen/Well in dreifacher Ausfertigung mit 10 % FBS DMEM (JN-DSRCT) oder RPMI (TC71 und LNCaP) Komplettmedium ausgesät. Weitere Einzelheiten zu WST1-Zellproliferationstests finden Sie in den ergänzenden Methoden. JN-DSRCT- und TC71-Zelllinien wurden von JL geliefert. LNCaP und PC3 wurden über das Zelllinien-Repository von MDACC bezogen.

Die JN-DSRCT-Zelllinie, die eine pathognomonische t(11;22)(p13;q12)-Translokation aufweist, wurde großzügigerweise vom Labor von Dr. M. Kikuchi (Universität Fukuoka, Fukuoka, Japan) zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden PC3-, LnCaP- und TC71-Zelllinien von der MDA-Zelllinien-Kernanlage bereitgestellt. Alle verfügbaren Zelllinien in Dr. Ludwigs Labor sind im MDA Characterized Cell Line Core (CCLC) registriert. Die Identität jeder Zelllinie wird zweimal pro Jahr im MDA-CCLC mithilfe von Short-Tandem-Repeat-Fingerprinting mit einem AmpFLSTR-Identifier-Kit validiert. Darüber hinaus werden alle unsere Zelllinien gemäß dem Protokoll des Herstellers zweimal pro Jahr mit dem MycoAlert Detection Kit (Lonza Group Ltd.) auf Mykoplasmenkontamination getestet. Darüber hinaus werden Zelllinien jedes Mal, wenn eine Zellsammlung kryokonserviert wird, für Mykoplasmentests an Dritte mit einem sensiblen PCR-Testansatz geschickt.

Die einschichtige JN-DSRCT-Zellkultur in 8-Kammer-Objektträgern wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Die primären JN-DSRCT-Xenotransplantat- und PDX-Tumoren wurden geerntet, in 10 % Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann in 5-μm-Schnitte geschnitten, bevor sie zur Antigengewinnung mit 0,1 M Citratpuffer für 20 Minuten und in a verarbeitet wurden Gemüsedampfer. Insgesamt wurden Monoschicht- und Primärtumorobjektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur permeabilisiert und mit Superblock-Puffer (Thermo Fisher Scientific, Nr. 37535) blockiert. Die Objektträger wurden dann nacheinander mit primären Antikörpern gegen AR (Cell Signaling Technologies, Nr. 5153) (über Nacht bei 4 °C) und Alexa Fluor 488-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen (Thermo Fisher Scientific, Nr. A11037) (1 Stunde lang) inkubiert Zimmertemperatur). Die Kerne wurden mit Hoechst (Thermo Fisher Scientific, Nr. H357) sichtbar gemacht und die Immunfluoreszenz wurde nach Subtraktion der Hintergrundintensitäten mit dem konfokalen Nikon A1-Rsi-Mikroskop (Nikon) erfasst. Der Fluoreszenznachweis von Proteinen in den Kernen und zytosolischen Regionen wurde mit der Imaris-Software (Bitplane) und ihrem Zellmodul quantifiziert, das validierte Algorithmen verwendet, um die Segmentierung zu definieren, indem es die Erkennung ausgewählter Proteinfluoreszenz sowohl in den Kern- als auch in den zytosolischen Regionen ermöglicht.

Alle Experimente wurden gemäß Protokollen und Bedingungen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas MDACC (Houston, TX) genehmigt wurden (eACUF Protocols #00000712-RN03). Männliche NOD (SCID)-IL-2Rgnull-Mäuse im Alter von 6 Wochen (The Jackson Laboratory; Farmington, CT) wurden subkutan mit JN-DSRCT-Zellen (5 × 106 Zellen/Tier) injiziert oder erhielten PDX-Explantate (2 mm), um DSRCT zu erzeugen Xenotransplantat- und PDX-Mausmodelle. Die histologischen und genetischen Analysen von DSRCT-Patienten und PDX-Tumoren sind in der ergänzenden Abbildung S12 verfügbar. Alle Mäuse wurden unter Barrierebedingungen gehalten und nach Protokollen behandelt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas MDACC genehmigt wurden. Sobald ihre Tumoren ein Volumen von 150 mm3 erreichten, erhielten 5 Mäuse pro Gruppe Enzalutamid (25 mg/kg IP täglich, 5-mal pro Woche) oder AR-ASOs (25 oder 50 mg/kg subkutan täglich, 5-mal pro Woche). oder Kontroll-ASOs (50 mg/kg subkutan täglich, 5-mal pro Woche) oder eine Placebo-Kontrolle (steriler Vehikelpuffer). Das Tumorvolumen wurde zu Beginn der Studie mit digitalen Messschiebern gemessen und danach zwei- bis fünfmal pro Woche bis zu 85 Tage lang bzw. bis die Tumorgröße 1.500 mm3 erreichte, je nachdem, was zuerst eintritt. Gemäß den institutionellen Anforderungen überschritt die Tumorgröße nie 2 cm in der maximalen linearen Dimension. Zur Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit wurde eine Kaplan-Meier-Analyse durchgeführt. Statistische Analysen zwischen der Kontroll- und der behandelten Gruppe oder zwischen verschiedenen behandelten Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) unter Verwendung von GraphPad Prism 8.0 durchgeführt.

Die Quantifizierung von Testosteron und Corticosteron wurde mithilfe der Infinity II UHPLC von Agilent in Verbindung mit einem 6495-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer und der MassHunter-Workstation-Software (8.0.8.23.5) bestimmt. Kurz gesagt, DSRCT-Xenotransplantat- und PDX-Proben wurden mit Wasser, das internen Standard (Cerilliant, T070) enthielt, homogenisiert, mit tert-Butylmethylether (Sigma 34875) extrahiert, unter Stickstoff getrocknet und mit Hydroxylaminhydrochlorid (Sigma 431362) derivatisiert. Die gewonnenen Ketoxim-Steroide wurden in Methanol/Wasser (1:1 v/v) rekonstituiert und in den Infinity II UHPLC injiziert. Ketoxim-Steroide wurden mithilfe einer Chromolith-Umkehrphasensäule (RP-18-Endkappe 100–2 mm, Sigma 152006) getrennt und zur Dreifach-Quadrupol-Analyse in eine JetStream-Quelle (Agilent) eingeführt. Die Daten wurden mit der MassHunter-Software (Agilent) analysiert und quantifiziert39,40.

Die Chromatin-Immunpräzipitation wurde wie zuvor beschrieben70 mit optimierten Scherbedingungen und geringfügigen Modifikationen für JN-DSRCT-Zellen durchgeführt. Die verwendeten Antikörper waren: H3K27ac (Abcam ab4729) und AR (CST#5153). Kurz gesagt, 3 Millionen Zellen pro Probe wurden mit 1 % Formaldehyd 10 Minuten lang bei 37 °C vernetzt. Nach 5-minütigem Abschrecken mit 150 mM Glycin bei 37 °C wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C eingefroren. Später wurden die Zellen auf Eis aufgetaut und mit ChIP-Erntepuffer (12 mM Tris-HCl, 0,1 × PBS, 6 mM EDTA, 0,5 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) 30 Minuten lang auf Eis lysiert. Lysierte Zellen wurden mit Bioruptor (Diagenode) beschallt, um Chromatinfragmente zu erhalten. Antikörper-Dynabead-Mischungen wurden 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert und Zellextrakte wurden dann über Nacht mit diesen Mischungen inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Immunkomplexe fünfmal mit RIPA-Puffer, zweimal mit RIPA-500 (RIPA mit 500 mM NaCl) und zweimal mit LiCl-Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 250) gewaschen mM LiCl, 0,5 % NP-40, 0,1 % Desoxycholat). Zur Rückvernetzung und Elution wurden Immunkomplexe über Nacht bei 65 °C in Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5 % SDS) inkubiert. Die eluierte DNA wurde dann mit Proteinase K (20 mg/ml) und RNase A behandelt und die DNA-Reinigung erfolgte unter Verwendung von SPRI-Kügelchen (Beckman-Coulter). ChIP-Bibliotheken wurden unter Verwendung des NEBNext® Ultra™ II DNA-Bibliotheksvorbereitungskits (New England Biolabs) amplifiziert und mit einem Barcode versehen. Nach der Bibliotheksamplifikation wurden die DNA-Fragmente mithilfe von AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter) größenselektiert (200–500 bp) und mit hochempfindlichem D1000-Siebband auf dem Bioanalyzer (Agilent Technologies) bewertet. Bibliotheken wurden in HiSeq2000 (Illumina) gemultiplext und sequenziert.

Rohe log2-Intensitätswerte wurden für die globale Proteinexpression durch Medianzentrierung über 151 getestete Antikörper normalisiert. Einzelne Proteinexpressionen in DSRCT-Proben, ES-Proben und mesenterialen Normalgewebeproben wurden mithilfe zweiseitiger ungepaarter t-Tests mit der GeneSpring GX-Softwareversion 12.6.1-GX (Agilent Technologies) verglichen. Für mehrere Vergleichstests wurden Proteine, deren Expressionsniveaus zwischen den Probentypen zweifach und signifikant unterschiedlich waren (p ≤ 0,05), einer unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterbildung unterzogen. Durch RPPA identifizierte differenziell exprimierte Proteine ​​wurden durch WB-Analyse bestätigt. Die RPPA-Daten für den proteomischen Vergleich von DSRCT-Patiententumoren, normalem Mesenterialgewebe und ES-Patiententumoren sind im Gene Expression Omnibus-Repository unter der Serie GSE108687 verfügbar.

Die Vorbereitung von extrahiertem Protein aus Zellen, DSRCT-Patiententumoren oder Xenotransplantat-Tiertumoren für Western-Blot-Validierungen erfolgte wie zuvor beschrieben62. Lysepuffer (1 % Triton und Phosphataseinhibitoren (Roche Applied Sciences) wurden angewendet, um zellulär gewaschene Pellets durch Kaltinkubation zu lysieren. Als nächstes wurde die Proteinextraktion aus Xenotransplantat-Tumoren durchgeführt, indem etwa 10 mg gefrorenes Gewebe in 500 μl des Lysepuffers unter Verwendung eines elektrischen Gewebehomogenisators (PRO Scientific) homogenisiert wurden. Die homogenisierten Tumoren wurden 2 Stunden lang bei +4 °C inkubiert, um ihre Dissoziation und Lyse abzuschließen. Insgesamt wurden die gesamten lysierten Proteine ​​​​von Tumoren nach der Zentrifugation gesammelt, mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und bis zur weiteren Analyse bei –80 ° C gelagert. WBs wurden wie zuvor von unserer Gruppe beschrieben durchgeführt61,62. Der Proteinnachweis wurde mithilfe einer Liste von Antikörpern durchgeführt, die in der obigen Zusatztabelle der für WBs verwendeten Antikörper enthalten sind. Die immunreaktiven Proteine ​​wurden mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Anti-Kaninchen-IgG- oder Anti-Maus-IgG-Antikörpern (Cell Signaling Technology) eingefangen, mit dem Chemilumineszenzsubstrat SuperSignal West Dura (Thermo Fisher Scientific) verstärkt und mit dem Chemi-Doc-System nachgewiesen (Bio-Rad) und anhand ihrer Densitometrie mit dem ImageJ Gel Analysis Tool (NIH, Bethesda, MD) quantifiziert.

Aus diesem TMA wurden ungefärbte 4-Mikrometer-Objektträger hergestellt. Immunhistochemische Studien wurden unter Verwendung eines Autostainers (Bond-Max; Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA) mit Anti-AR-Antikörper (1:30; Klon AR441, Dako#M3562) durchgeführt. Dieser Primärantikörper wurde mit einem Bond Polymer Refine Detection Kit gemäß dem Herstellerprotokoll (Leica, #DS9800) nachgewiesen. Anschließend wurden die Objektträger in hochwertigen Alkoholen dehydriert, in Xylol geklärt und abgedeckt. Die Ergebnisse der TMA-Färbung wurden nach Intensität (niedrig, mäßig und hoch) sowie dem Prozentsatz der Tumormarkierung (positiv (>50 %), schwach positiv (10–50 %), fokal (1–10 %) usw. bewertet negativ (0–1 %).

Die Zellen wurden 24 Stunden lang kultiviert, um sie anhaften zu lassen, bevor seriell verdünnte Konzentrationen von Dihydrotestosteron (DHT, 0,0064–2000 nM; Selleckchem) oder AR-basierte medikamentöse Behandlungen (Enzalutamid, AR-ASO; 0,032–5 mM) für bis zu 24 Stunden hinzugefügt wurden 48 bzw. 72 Stunden. WST1 wurde hinzugefügt und die Zellen wurden weitere 2 Stunden lang inkubiert. Die Zellproliferation wurde bei 450 nm in einem Mikroplattenlesegerät (DTX880, Beckman Coulter) gemessen. In beiden Tests wurde die agonistische Wirkung von DHT bzw. die zytotoxische Wirkung der Arzneimittel als Prozentsatz der Zellproliferation ausgedrückt. Die IC50-Werte wurden durch die Anpassung der sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurve mit Prism GraphPad 8.0 berechnet.

Primärtumoren aus der DSRCT-Xenotransplantat- und PDX1-Gruppe von Mäusen, unbehandelt und mit Kontroll-ASO oder AR-ASO behandelt, wurden in 10 % Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und dann in 5 μm-Schnitte geschnitten. Das mikrowellenbasierte Vorbehandlungs- und Antigen-Retrieval-System EZ-Retriever (Biogenex, CA) wurde zum Entparaffinieren, Rehydrieren und Antigen-Retrieval dieser FFPE-Lungengewebeschnitte verwendet. Die AR-Proteinexpression durch IHC wurde auf dem Leica Bond MAX Autostainer unter Verwendung eines Primärantikörpers, Kaninchen-Antikörper-Anti-Human-AR (Cell Signaling Technologies, Nr. 5153), bewertet. Der primäre Antikörper wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (Leica, #DS9800) nachgewiesen. Anschließend wurden die Objektträger in hochwertigen Alkoholen dehydriert, in Xylol geklärt, abgedeckt und mit einem Keyence-Mikroskop (Keyence, Tokio, Japan) bei 20-facher Auflösung abgebildet. Die digitalen Bilder wurden mit der Visiopharm-Softwareversion (2020.04) (Hoersholm, Dänemark) verarbeitet und quantifiziert. Ein APP (Analysis Protocol Package) wurde entwickelt, um die zellbasierte DAB-Färbung in präklinischen DSRCT-Proben mithilfe herkömmlicher Schwellenwertmethoden zu quantifizieren. Der Algorithmus basiert auf einem dreistufigen Ansatz: (1) Vorverarbeitung: HDAB-DAB- und HDAB-Hämatoxylin-Merkmale wurden verwendet, um AR-positive Zellen (grüne Maskierung) bzw. negative Zellen (blaue Maskierung) durch Einstellung zu erkennen Pixelwerte. Für die ordnungsgemäße Segmentierung der Zellen wurde ein Medianfilter der Größe 5 × 5 verwendet. (2) Nachbearbeitung: Zusätzliche Schritte wurden entwickelt, um die Leistung der APP zu verbessern. Die Änderung durch Form schließt die Artefakte aus; Zusammengeführte Zellen wurden durch einen separaten Beschriftungsschritt getrennt und bestimmte freie Bereiche in den Zellen wurden mit einem Fülllochschritt gefüllt, um die Zellen vollständig zu maskieren. (3) Ausgabevariable: Die mittlere Intensität jeder Zelle und jeder Probe wurde extrahiert und in eine Tabellenkalkulation exportiert. Abschließend wurden die Daten mithilfe der GraphPad Prism-Software, Version 8, in einem Streudiagramm dargestellt, das die mittlere AR-Intensität jeder Zelle aus allen analysierten Proben und die mittlere AR-Intensität aus jeder präklinischen Gruppe behandelter Mäuse zeigt.

ChIP-seq-Daten wurden qualitätskontrolliert und von pyflow-ChIP-seq71 verarbeitet, einer auf Snakemake72 basierenden ChIP-seq-Pipeline. Kurz gesagt, Rohlesevorgänge wurden von bowtie173 auf hg19 abgebildet. Doppelte Lesevorgänge wurden entfernt und nur eindeutig zugeordnete Lesevorgänge wurden beibehalten. RPKM-normalisierte Bigwigs wurden mit Deep Tools74 generiert und Spuren wurden mit IGV75 visualisiert. Peaks wurden mit macs1.476 mit einem ap-Wert von 1e–9 für H3K27ac und 1e–7 für AR ermittelt. Heatmaps wurden mit dem R-Paket EnrichedHeatmap generiert. ChIP-seq-Peaks wurden mit ChIPseeker77 mit den nächstgelegenen Genen versehen. SEs wurden mithilfe von ROSE78 basierend auf H3K27ac-ChIP-seq-Daten identifiziert.

Um variable AR- oder Enhancer-Domänen zu identifizieren, die in bestimmten DSRCT-Proben angereichert sind, wurden Enhancer-Peaks entfernt, die sich 2,5 kb stromaufwärts und 2,5 kb stromabwärts aller bekannten TSSs überlappen. Die einzigartigen und gemeinsamen Peaks innerhalb mehrerer Gruppen wurden von Intervene79 identifiziert. Die Peaks wurden mit dem ChIPseeker R-Paket77 kommentiert, wobei die Funktion addFlankGeneInfo für Enhancer verwendet wurde.

Differenzielle AR-Bindungsstellen und Enhancer-assoziierte Gene in jeder Probe wurden zur Signalweganalyse in den ClusterProfiler80 importiert, beschränkt auf GO-, KEGG-, Hallmark- und WiKi-Gensätze. Das Enrichplot-Paket81 wurde verwendet, um Punktdiagramme und Balkendiagramme für Gensätze zu erstellen, die mit einem Grenzwert für die Falscherkennungsrate von <0,05 angereichert wurden.

Um die Motive zu identifizieren, die in AR-spezifischen Peak-Sets überrepräsentiert sind, verwendeten wir die HOMER-Motivdatenbank und die Koordinaten der AR-spezifischen Peak-Sets82.

Balken- und Streupunktdiagramme werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Boxplots zeigen den Medianwert und den Interquartilbereich an; Whisker zeigen minimale und maximale Datenpunkte. Alle p-Werte des T-Tests sind zweiseitig. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, wurden jeder Gruppe mindestens fünf Tiere zugeteilt. Für jedes Mikroskopiebild wurden drei oder mehr interessierende Bereiche nach dem Zufallsprinzip bewertet, und repräsentative Bilder werden angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, werden im Artikel, in den Zusatzinformationen und in den Quelldaten bereitgestellt. Alle ChIP-seq-Daten sind unter der GEO-Zugangsnummer GSE151380 verfügbar und wurden am 1. September 2022 öffentlich veröffentlicht. RNA-seq-Daten werden im European Genome-Phenome Archive öffentlich verfügbar gemacht: DSRCT unter EGAS00001004575; Liposarkom bei EGAS00001002807; Osteosarkom bei EGAS00001003247; Chondrosarkom bei EGAS00001004585; und Prostatakrebs durch Subudhi et al.83. RPPA DSRCT GEO (GSE108687) RNA-Seq DSRCT EGAS00001004575 [https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001006394]. RNA-Seq LS-Daten EGAS00001002807. RNA-Seq OS-Daten EGAS00001003247. RNA-Seq CS-Daten EGAS00001004585. RNA-Seq für PC: EGAS00001004050. RPPA-Daten GEO (GSE178406). AR-ChIP-seq GEO (Zugangsnummer: GSE151380). H3K27Ac ChIP-seq GEO (Zugangsnummer: GSE151380). Zusätzliches RPPA GEO (Zugangsnummer: GSE178406).

Der zum Generieren der ChIP-seq-Daten verwendete Code ist unter https://github.com/crazyhottommy/pyflow-ChIPseq verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Forscher am MD Anderson Cancer Center der University of Texas werden von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant CA016672 unterstützt. Die Characterized Cell Line Core Facility wird vom NIH finanziert [CA016672]. KR und MM wurden durch Zuschüsse des NCI (CA222214, CA245395, CA226269), des Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT; RP220410 und RP200390) und interner Mittel des MDACC unterstützt. PAF wird vom Cancer Prevention Research Institute (R120501) und dem Robert A. Welch Distinguished University Chair Award (G-0040) der Welch Foundation unterstützt. Wir danken der Cory Monzingo Foundation und der Blake Abercrombie Foundation für ihre großzügige Philanthropie, die diese Arbeit unterstützt hat.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Salah-Eddine Lamhamedi-Cherradi, Mayinuer Maitituoheti.

Die folgenden Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Salah-Eddine Lamhamedi-Cherradi, Kunal Rai, Joseph A. Ludwig.

Abteilung für medizinische Onkologie bei Sarkomen, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Salah-Eddine Lamhamedi-Cherradi, Sandhya Krishnan, Amelia M. Vetter, Robert W. Porter, Danh D. Truong, Alejandra Ruiz Velasco, Ravin Ratan, J. Andrew Livingston und Joseph A. Ludwig

Abteilung für Genommedizin, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Mayinuer Maitituoheti, Chia-Chin Wu, Hannah C. Baird, Vandhana Ramamoorthy und Kunal Rai

Abteilung für Chirurgie, Brustchirurgische Onkologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Brian A. Menegaz

Texas Children's Cancer & Hematology Centers, Houston, TX, 77384, USA

Pamela Camacho

Abteilung für Pathologie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Davis R. Ingram, P. Andrew Futreal, Nazanin Esmaeili Anvar, Alexander J. Lazar und Wei-Lien Wang

Abteilung für Pädiatrie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Sana Mohiuddin, David McCall, Branko Cuglievan und Najat C. Daw

Einrichtung für optische Mikroskopie, Rice University, Houston, TX, 77030, USA

Budi Utama

Abteilung für urogenitale medizinische Onkologie, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Mark Titus

Abteilung für experimentelle Therapeutik, MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Houston, TX, 77030, USA

Christian Rodriguez-Aguayo

Ionis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA, 92010, USA

A. Robert MacLeod

Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC, Chapel Hill, NC, 27599, USA

Andrea Hayes-Jordan

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S.-EL-C., MM, BAM, SK, ARV, PC, RWP, VR, SM, DDT, ARV, MT, JALu., W.-LW und CR-.A. entwarf Experimente, führte Experimente durch und analysierte Daten. DRI half dabei, klinische Proben für die Analyse zu identifizieren und zu sammeln. S.-EL-C., JALu., AH-J. und KR analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. PAF, MT, ARM, NCD, RR, JALi. und AH-J. lieferte wichtige wissenschaftliche Beiträge und Fachkenntnisse. S.-EL-C., NCD, BC, DM, AH-J., RR, JALi. und JALu. half dabei, die in die Studie aufgenommenen DSRCT-Patienten zu identifizieren. BU unterstützte bei der konfokalen Mikroskopie. W.-LW und AJL lieferten pathologische Interpretationen. CR-A. Unterstützung bei präklinischen In-vivo-Experimenten. MT führte die massenspektroskopische Analyse durch. C.-CW, HCB und PAF führten die transkriptomische Analyse durch. NEA, MM und KR führten die ChIP-seq-Experimente durch und halfen bei deren Interpretation. Alle Autoren beteiligten sich an der Dateninterpretation und Manuskriptbearbeitung.

Korrespondenz mit Salah-Eddine Lamhamedi-Cherradi, Kunal Rai oder Joseph A. Ludwig.

ARM ist Mitarbeiter und Anteilseigner von Ionis Pharmaceuticals. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lamhamedi-Cherradi, SE., Maitituoheti, M., Menegaz, BA et al. Der Androgenrezeptor ist ein therapeutisches Ziel beim desmoplastischen kleinzelligen Sarkom. Nat Commun 13, 3057 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30710-z

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Eingegangen: 09. Oktober 2020

Angenommen: 13. Mai 2022

Veröffentlicht: 01. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30710-z

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